Diferentes efectos del hidrógeno.

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 7231 (2022) Citar este artículo

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Actualmente se ha confirmado el potencial de aplicaciones preventivas y terapéuticas del H2 en diversas enfermedades. Sin embargo, los efectos del H2 sobre el estado de salud no se han dilucidado completamente. Nuestro estudio anterior informó cambios en el peso corporal y 13 parámetros bioquímicos séricos durante la intervención de hidrógeno de seis meses. Para obtener una comprensión más completa de los efectos del consumo de hidrógeno a largo plazo, en este estudio se investigaron el metaboloma plasmático y la microbiota intestinal. En comparación con el grupo de control, se identificaron 14 y 10 metabolitos diferenciales (DM) en el grupo de agua rica en hidrógeno (HRW) y en el grupo de inhalación de hidrógeno (HI), respectivamente. El análisis de enriquecimiento de la vía mostró que la ingesta de HRW afectó principalmente al metabolismo del almidón y la sacarosa, y los DM en el grupo HI se enriquecieron principalmente en la biosíntesis de arginina. La secuenciación del gen 16S rRNA mostró que la ingesta de HRW indujo cambios significativos en la estructura de la microbiota intestinal, mientras que no se observaron diferencias marcadas en la comunidad bacteriana en el grupo HI. La ingesta de HRW indujo principalmente un aumento significativo en la abundancia de Lactobacillus, Ruminococcus, Clostridium XI y una disminución de Bacteroides. HI indujo principalmente una disminución de la abundancia de Blautia y Paraprevotella. La función metabólica se determinó mediante análisis de jaula metabólica y mostró que el HI disminuyó la ingesta voluntaria y las excreciones de las ratas, mientras que la ingesta de HRW no. Los resultados de este estudio proporcionan datos básicos para futuras investigaciones sobre la medicina del hidrógeno. La determinación de los efectos de la intervención del hidrógeno en los perfiles de la microbiota también podría arrojar luz sobre la identificación del mecanismo subyacente a los efectos biológicos del hidrógeno molecular.

El hidrógeno (H2) es la molécula de gas más pequeña y ligera, que históricamente ha sido considerada una molécula biológicamente inerte. A principios de 1975, Dole et al. informaron por primera vez sobre el posible efecto anticancerígeno del tratamiento hiperbárico con gas hidrógeno al 97,5% en un modelo de tumor de piel en ratón1. Sin embargo, los investigadores médicos no prestaron considerable atención al H2 hasta que Ohsawa et al. informaron que la inhalación de 1 a 4% de gas H2 atenúa significativamente la lesión por isquemia-reperfusión cerebral en ratas al neutralizar selectivamente los radicales hidroxilo y el peroxinitrito2. El potencial de las aplicaciones preventivas y terapéuticas del H2 se ha confirmado en más de 170 modelos diferentes de enfermedades humanas y animales, incluidas lesiones por isquemia-reperfusión (I/R)3,4, neurodegeneración5,6, enfermedades cardiovasculares7,8, síndrome metabólico9, 10, inflamación11,12 y cáncer13,14. Se han propuesto varios mecanismos biológicos, incluida la reducción selectiva de los radicales citotóxicos de oxígeno2, los efectos antiinflamatorios15, la recuperación de la disfunción mitocondrial16, la regulación del estrés del retículo endoplásmico17, pero ninguno de ellos puede explicar completamente las múltiples funciones biológicas del H2.

En los mamíferos, el microbioma intestinal forma un ecosistema complejo que consta de una gran cantidad de bacterias, arqueas, bacteriófagos, virus eucariotas y hongos que interactúan, la mayoría de los cuales son microorganismos comensales o mutualistas18. En la última década se ha demostrado que la microbiota intestinal desempeña un papel profundo en el entrenamiento de la inmunidad del huésped, la digestión de los alimentos, la regulación de la función endocrina intestinal y la señalización neurológica, la modificación de la acción y el metabolismo de los fármacos, la eliminación de toxinas y la producción de numerosos compuestos que influyen en el huésped19. En la actualidad, la investigación sobre la relación entre el consumo de hidrógeno y el microbioma intestinal es relativamente limitada. La mayoría de los estudios demostraron que el agua rica en hidrógeno (HRW) podría mejorar la integridad estructural intestinal y la regulación positiva de las bacterias productoras de butirato con una mejora de las características clínicas de las alteraciones de la microbiota intestinal20. Sin embargo, estos estudios se han centrado principalmente en el efecto modulador del consumo de HRW sobre la flora intestinal en condiciones patológicas; aún se desconoce en gran medida si la administración de HRW regula el microbioma intestinal en animales sanos. Además, como otro método de consumo de hidrógeno comúnmente utilizado, es necesario investigar más a fondo si la inhalación de hidrógeno también podría afectar el microbioma intestinal.

Uno de los objetivos del presente estudio fue explorar los posibles efectos regulatorios de la ingesta a largo plazo de HRW y la inhalación de hidrógeno en el microbioma intestinal. Nuestro estudio anterior demostró que la ingesta a largo plazo de HRW o la inhalación de hidrógeno pueden influir en algunos parámetros bioquímicos séricos de ratas normales, lo que indica el posible efecto modulador del consumo de hidrógeno sobre el metabolismo en el estado de salud21. Para investigar más a fondo el efecto del consumo de hidrógeno en el metabolismo, se realizó un análisis metabolómico pseudodirigido basado en LC-MS para determinar los cambios en los niveles de metabolitos plasmáticos. También se investigó la relación entre los metabolitos plasmáticos expresados diferencialmente y la microbiota intestinal alterada.

Como se informó en nuestro estudio anterior21, después de una intervención de hidrógeno de 6 meses, el peso corporal (PC) de las ratas en el grupo HI disminuyó significativamente (455,20 ± 31,57 g vs. 525,00 ± 17,78 g, p = 0,007) en comparación con los controles, mientras que No se observaron cambios significativos en BW en el grupo HRW. El peso corporal de las ratas fue menor en el grupo HI que en el grupo HRW (455,20 ± 31,57 g vs. 498,80 ± 18,50 g, p = 0,012) (Fig. 1A).

Los efectos de la intervención con hidrógeno sobre el peso corporal y la función metabólica de las ratas. (A) Cambios de BW a los seis meses después del tratamiento con hidrógeno; (B) cambios de BW durante el primer mes después del tratamiento con hidrógeno; (C – F) los efectos del tratamiento con hidrógeno en la ingesta de alimentos (C), la ingesta de agua (D), la defecación (E) y la orina (F).

Para determinar los efectos de la intervención con hidrógeno sobre la función metabólica, realizamos otro estudio utilizando jaulas metabólicas para medir la ingesta voluntaria y las excreciones de ratas durante 24 horas durante el primer mes de intervención con hidrógeno. En comparación con el grupo de control, tanto HRW como HI no tuvieron un efecto significativo sobre el peso corporal de las ratas durante las cuatro semanas; sin embargo, el peso corporal fue significativamente menor en la primera (263,29 ± 19,98 g vs. 296,56 ± 19,69 g, p = 0,012). y la cuarta semana (383,21 ± 29,36 g vs. 428,81 ± 31,21 g, p = 0,024) después de la HI. En comparación con el grupo HRW, el peso corporal de las ratas en el grupo HI fue menor con una significación marginal (p = 0,063) durante las cuatro semanas (Fig. 1B). Como se muestra en la Fig. 1C, D, en comparación con el grupo de control, HI indujo una disminución significativa tanto en la ingesta de alimentos (p <0,0001) como en la ingesta de agua (p <0,0001), mientras que no se observó ninguna reducción en el grupo HRW. Durante las cuatro semanas, la defecación (p = 0,002, Fig. 1E) y la micción (p = 0,006, Fig. 1F) también disminuyeron notablemente en el grupo HI, mientras que no se observó ningún efecto en el grupo HRW. El análisis de correlación de Spearman reveló que la reducción de la defecación de las ratas en el grupo HI se relacionó positivamente con la reducción de la ingesta de alimentos (r = 0,43, p = 0,006), y la disminución de la orina también se relacionó positivamente con la reducción de la ingesta de agua (r = 0,64, p < 0,0001).

Para determinar los efectos de la intervención de hidrógeno en los metabolitos plasmáticos, se realizó un análisis de metabolómica pseudodirigida basado en LC-MS en muestras de plasma en ayunas. Se identificaron ochenta y seis metabolitos plasmáticos que consisten en aminoácidos y sus derivados, intermediarios en la glucólisis y el ciclo del ácido cítrico, metabolitos de lípidos, metabolitos de nucleótidos, metabolitos del ciclo de la urea, carbohidratos, cofactores/vitaminas y hormonas. Para identificar la diferencia en los niveles de metabolitos plasmáticos entre grupos, se realizaron análisis de componentes principales (PCA) y análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA). El análisis de PCA mostró que los grupos HRW y CON estaban claramente segregados por componentes principales (PC) 1 (18,91%) y 2 (15,26%) (Fig. 2A). También se observó la segregación de HI y CON (PC1: 18,94%, PC2: 14,45%, Fig. 2B), así como de HRW y HI (PC1: 24,69%, PC2: 11,68%, Fig. 2C). El modelo OPLS-DA del perfil metabólico plasmático mostró una buena discriminación entre HRW y CON (R2X = 0,262, R2Y = 0,991, Q2 = 0,645, Fig. 2D,G), HI y CON (R2X = 0,269, R2Y = 0,968, Q2 = 0,359, Fig. 2E,H), HRW y HI (R2X = 0,325, R2Y = 0,976, Q2 = 0,684, Fig. 2F,I).

La diferencia en el perfil de metabolitos plasmáticos entre los grupos se identificó mediante análisis PCA y OPLS-DA. (A) Gráfico PCA de HRW frente a CON; (B) Gráfico PCA de HI frente a CON; (C) Gráfico PCA de HRW frente a HI; (D) Gráfico de puntuación OPLS-DA de HRW frente a CON; (E) Gráfico de puntuación OPLS-DA de HI frente a CON; (F) Gráfico de puntuación OPLS-DA de HRW frente a HI; (G – I) Gráfico de validación obtenido de 200 pruebas de permutación, respectivamente.

Los metabolitos diferenciales (DM) se seleccionaron utilizando el límite de la puntuación OPLS-DA VIP> 1,0 con un valor de p <0,05 en el cambio del nivel de expresión entre dos de los tres grupos. Se identificaron treinta y cinco DM como se muestra en la Tabla complementaria 1. En comparación con el grupo de control, hay 14 y 10 DM en el grupo HRW y HI respectivamente. Se identificaron veintidós DM entre el grupo HRW y HI. En comparación con el grupo de control, todos los DM estaban regulados negativamente en el grupo HRW, mientras que todos los DM estaban regulados positivamente en el grupo HI. En comparación con el grupo HRW, todos los DM estaban regulados positivamente en el grupo HI. Como se muestra en la Fig. 3A, el dendrograma de agrupamiento jerárquico mostró que las muestras de plasma en el grupo HRW se agruparon por separado del grupo de control o del grupo HI; sin embargo, la diferencia entre el grupo HI y el grupo de control fue mucho menor. El análisis de enriquecimiento de la vía basado en alteraciones cuantitativas de los metabolitos se realizó mediante MetaboAnalyst 5.0 (//www.metaboanalyst.ca). Las vías metabólicas con valor de impacto > 0,1 y − log(p) > 2,0 se consideran las vías más relevantes involucradas en las condiciones en estudio. Los resultados mostraron que los DM entre HRW y el grupo control se concentraron principalmente en el metabolismo del almidón y la sacarosa (Fig. 3B), los DM entre HI y el grupo control estuvieron involucrados principalmente en la biosíntesis de arginina (Fig. 3C), los DM entre HRW y HI El grupo se enriqueció principalmente en el metabolismo de glicerolípidos, metabolismo de fosfato de inositol, metabolismo de almidón y sacarosa, metabolismo de glioxilato y dicarboxilato, y metabolismo de ascorbato y aldarato (Fig. 3D).

Análisis de metabolitos diferenciales en muestras de plasma entre tres grupos. (A) Los resultados de agrupamiento jerárquico para metabolitos diferenciales. (B – D) El análisis de enriquecimiento funcional para metabolitos diferenciales entre dos grupos. NAAG Ácido N-acetilaspartilglutámico, CMP Citidina 5′-monofosfato.

Para investigar los efectos de la intervención con hidrógeno en la estructura de la microbiota fecal, analizamos las comunidades bacterianas en las muestras mediante la secuenciación del gen 16S rRNA (región V3-V4) utilizando Illumina MiSeq. El recuento de secuencias de alta calidad (CON: 35.896 ± 766, HRW: 36.063 ± 884, HI: 35.630 ± 845) y el recuento de unidades taxonómicas operativas (OTU) (CON: 551 ± 76, HRW: 516 ± 11, HI: 559 ± 84 ) fueron similares en los tres grupos. Cuatro medidas de diversidad α [Chao1 (Fig. 4A), PD de árbol completo (Fig. 4B), Shannon (Fig. 4C) y Simpson (Fig. 4D)] no logran informar diferencias significativas entre el grupo de control y HRW. o grupo HI. Sin embargo, el índice de PD de todo el árbol fue significativamente mayor en el grupo HI que en el grupo HRW (Fig. 4B). Se realizó un análisis de similitudes (ANOSIM) para comparar cuantitativamente las diferencias de la comunidad bacteriana entre diferentes grupos. Como se muestra en la Fig. 4E, ANOSIM reveló una diferencia significativa en la estructura de la microbiota intestinal entre HRW y el grupo de control (ANOSIM, r = 0,304, p = 0,005). También se observaron diferencias significativas en la comunidad bacteriana entre el grupo HRW y HI (Fig. 4G, ANOSIM, r = 0,369, p = 0,003). Sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa entre HI y el grupo de control (Fig. 4F, ANOSIM, r = − 0,065, p = 0,65). Se realizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para identificar diferencias en la abundancia relativa de bacterias entre los dos grupos. A nivel de filos, como se muestra en la Fig. 4H, los filos dominantes de los tres grupos fueron Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria y Actinobacteria. En comparación con los controles, el porcentaje relativo de Elusimicrobia aumentó significativamente en el grupo HRW, mientras que la proporción de Deferribacteres y Euryarchaeota disminuyó notablemente en el grupo HRW. HI solo indujo un aumento marcado en la proporción de Elusimicrobia. En comparación con el grupo HRW, la proporción de Elusimicrobia fue significativamente menor y Spirochaetes y Euryarchaeota fueron notablemente mayores en el grupo HI. A nivel familiar, como se muestra en la Fig. 4I, la familia dominante de la microbiota fecal fueron Prevotellaceae, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae y Lactobacillaceae. La abundancia de Lactobacillaceae, Peptostreptococcaceae y Elusimicrobiaceae aumentó, y la abundancia de Bacteroidaceae y Desulfovibrionaceae disminuyó en el grupo HRW en comparación con los controles. La disminución de la abundancia en Porphyromonadaceae y el aumento de la abundancia en Elusimicrobiaceae se observaron en el grupo HI en comparación con los controles. En comparación con el grupo HRW, en el grupo HI se observó una mayor abundancia en Acidaminococcaceae y una disminución en la abundancia en algunos otros filos (p. ej., Lactobacillaceae, Porphyromonadaceae, Peptostreptococcaceae y Sphingomonadaceae). A nivel de género, como se muestra en la Tabla complementaria 2, en comparación con el grupo de control, once y siete géneros exhibieron abundancias significativamente diferentes en el grupo HRW y HI, respectivamente. En comparación con el grupo HRW, veintitrés géneros mostraron diferencias significativas en la abundancia relativa de bacterias en el grupo HI.

Análisis de la composición de la comunidad bacteriana entre tres grupos. (A – D) La diversidad alfa de la comunidad bacteriana se midió mediante Chao1 (A), PD del árbol completo (B), Shannon (C) y Simpson (D); (E – G) Se realizó ANOSIM para comparar cuantitativamente las diferencias de la comunidad bacteriana entre diferentes grupos. (H,I) El análisis de diagramas de barras de la comunidad muestra la abundancia relativa de microbiota en cada grupo a nivel de filo (H) y nivel de familia (I), n = 6, en cada grupo.

Para determinar si los cambios en los taxones microbianos intestinales alterarían la función de la microbiota intestinal, PICRUSt realizó la predicción funcional en el nivel 3 de la vía KEGG. Como se muestra en la Fig. 5, en comparación con el grupo de control, la microbiota fecal de las ratas del grupo HRW tenía vías elevadas involucradas en la biogénesis de los ribosomas y las proteínas de replicación, recombinación y reparación. El grupo HI tenía una vía significativamente enriquecida involucrada en la biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano. En comparación con el grupo HRW, el grupo HI tenía vías reducidas involucradas en la biogénesis de ribosomas, cromosomas y proteínas de recombinación y reparación.

Vías KEGG enriquecidas diferencialmente. La predicción funcional en el nivel 3 de la vía KEGG se realizó mediante PICRUSt entre HRW y el grupo de control (A), HI y el grupo de control (B), HRW y el grupo HI (C).

Para examinar la posible relación entre los metabolitos plasmáticos expresados diferencialmente y la microbiota intestinal alterada a nivel de género, se realizó un análisis multiómico mediante la prueba de correlación de Spearman. Los resultados del análisis de correlación de Spearman entre HRW y el grupo de control se muestran en la Fig. 6A; la abundancia de ácido urocánico tuvo la correlación más fuerte con Bacteroides (r = 0,944, p <0,0001). El ácido L-láctico mostró correlaciones positivas moderadas comparables con Desulfovibrio y Bacteroides. La N-Acetil-l-alanina y la N-Acetil-D-glucosamina también mostraron una correlación positiva moderada con Bacteroides y Elusimicrobium. La d-glucosa 6-fosfato mostró correlaciones negativas moderadas con Elusimicrobium, Clostridium XI y Barnesiella. La Figura 6B mostró el análisis de correlación de Spearman entre HI y el grupo de control, el ácido málico tuvo la correlación más fuerte con Blautia (r = 0,879, p = 0,0002). La l-leucina mostró una correlación positiva moderada con Blautia. El ácido N-carbamoil-l-aspártico, el ácido cis-acónico y la inosina también mostraron correlaciones positivas moderadas con Paraprevotella. El ácido N-carbamoil-l-aspártico mostró una correlación negativa moderada con Bifidobacterium. La Figura 6C mostró el análisis de correlación de Spearman entre el grupo HRW y HI, la l-fenilalanina mostró correlaciones positivas altas con Sphingomonas (r = 0,866, p = 0,0003), Methylocacterium (r = 0,921, p < 0,0001) y Bosea (r = 0,848, p = 0,0005). El ácido glicérico también mostró correlaciones positivas altas con Lactobacillus (r = 0,937, p < 0,0001) y Mycoplasma (r = 0,881, p = 0,0002). La N6-metiladenosina mostró una alta correlación positiva con Lactobacillus (r = 0,895, p < 0,0001), mientras que tuvo una fuerte correlación negativa con Methanosphaera (r = − 0,834, p = 0,0007).

Análisis de correlación entre géneros significativamente diferentes y metabolitos plasmáticos diferenciales. Se realizó la prueba de correlación de Spearman entre HRW y el grupo de control (A), HI y el grupo de control (B), HRW y el grupo HI (C).

Nuestro estudio anterior informó que HI puede inducir una disminución significativa en el peso corporal de las ratas, mientras que HRW no lo hizo21. De acuerdo con estudios anteriores, los resultados de este estudio también mostraron una marcada disminución en el BW en el grupo HI, mientras que no se observó ningún efecto obvio en el grupo HRW. Los experimentos de la jaula metabólica mostraron que la HI podía disminuir significativamente la ingesta de alimentos, la ingesta de agua, la defecación y la micción. La función metabólica disminuida puede contribuir a la reducción del peso corporal en el grupo HI. Nuestro estudio anterior también demostró que tanto la ingesta de HRW como la HI pueden inducir cambios significativos en varios parámetros bioquímicos séricos en ratas normales21. Para obtener una comprensión más completa de las alteraciones metabólicas en respuesta a la ingesta de HRW o HI, se realizó un análisis de metabolómica pseudodirigida basado en LC-MS. Los modelos OPLS-DA indicaron separaciones claras entre dos de los tres grupos en función de sus respuestas metabolómicas. En comparación con el grupo de control, se identificaron 14 y 10 DM en el grupo HRW y HI, respectivamente. Vale la pena señalar que todos los DM en el grupo HRW estaban regulados a la baja, mientras que todos los DM estaban regulados al alza en el grupo HI, se identificaron 22 DM entre los grupos HRW y HI, lo que indica que los efectos moduladores de la ingesta de HRW en el metabolismo difieren notablemente. de Hola. Un análisis de enriquecimiento funcional adicional sugirió que los DM estaban involucrados principalmente en el metabolismo del almidón y la sacarosa y en la biosíntesis de arginina en el grupo HRW y HI, respectivamente.

Un estudio anterior demostró que 4 semanas de ingesta de HRW podrían disminuir significativamente los niveles de glucosa en sangre, lactato y nitrógeno ureico en sangre (BUN) y ejercer efectos antifatiga en ratones con natación forzada crónica22. También se ha informado que 3 meses de ingesta de HRW podrían disminuir notablemente los niveles de ácido úrico en sangre en pacientes masculinos con hiperuricemia23. De acuerdo con estos hallazgos, nuestros resultados también mostraron que 6 meses de ingesta de HRW podrían regular negativamente los niveles plasmáticos de D-glucosa 6-fosfato, ácido L-láctico y ácido úrico. Además, los niveles plasmáticos de nucleótidos y sus derivados también se redujeron después de la ingesta de HRW, lo que indica los efectos reguladores de la ingesta de HRW sobre el metabolismo de los nucleótidos. En particular, todos los derivados de nucleótidos modificados, incluidos m6A, pseudouridina y N2,N2-dimetilguanosina, pertenecían a modificaciones de ARN. Entre ellos, m6A es la modificación epigenética más extendida en el ARNm de mamíferos y se ha demostrado que actúa como un regulador clave de numerosos procesos biológicos importantes en la fisiología normal y en enfermedades, incluidos el cáncer, la insuficiencia cardíaca, las infecciones virales y la diabetes tipo 224,25. . Se informó que la pseudouridina sufre cambios dinámicos en respuesta a la falta de suero, el peróxido de hidrógeno y el choque térmico en células de mamíferos24. Anteriormente se informó que la administración de H2 podría regular la expresión de diversos genes26; nuestros resultados sugieren que el hidrógeno molecular puede regular la expresión génica al afectar las modificaciones epigenéticas. Además, los niveles plasmáticos de N1-metil-2-piridona-5-carboxamida disminuyeron significativamente con la ingesta de HRW. La nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) es una coenzima importante para las reacciones redox, lo que la convierte en fundamental para el metabolismo energético27. El mononucleótido de nicotinamida (NMN) es uno de los sustratos para la síntesis de NAD+, que puede metabolizarse aún más a N1-metil-2-piridona-5-carboxamida. Por lo tanto, la ingesta de HRW puede regular el metabolismo energético al afectar la síntesis de NAD+.

A diferencia de la ingesta de HRW, el HI tuvo efectos reguladores positivos sobre la DM plasmática. Seis de esos DM, incluidos l-citrulina, l-leucina, sarcosina, ácido l-glutámico, ácido N-carbamoil-l-aspártico y NAAG, pertenecían a aminoácidos y sus derivados. Entre ellos, los niveles plasmáticos de l-citrulina mostraron el aumento más considerable en el grupo HI en comparación con los controles. Se ha demostrado en ratas que sólo el intestino produce citrulina circulante, y el aumento de los niveles de citrulina puede deberse a un aumento de la producción o a una disminución de la utilización28. La disminución de la utilización podría deberse a una disminución del aclaramiento, es decir, insuficiencia renal. Sin embargo, en nuestro estudio no se observó ningún cambio significativo en los niveles plasmáticos de creatinina, lo que indica que el aumento de los niveles de citrulina no fue causado por el deterioro de la función renal. Un estudio anterior demostró que el aumento de la citrulina plasmática se correlacionaba con una mejora en la absorción de proteínas en pacientes con síndrome del intestino corto (SIC) seguido durante el primer año después de la resección29. Suponemos que el aumento de los niveles plasmáticos de citrulina puede estar asociado con la mejora de la función de los enterocitos, aunque esto debe investigarse más a fondo. HI también indujo un aumento significativo en los niveles plasmáticos de NAAG. NAAG es el dipéptido más prevalente y ampliamente distribuido en el sistema nervioso de los mamíferos30. Los niveles de NAAG en plasma y líquido cefalorraquídeo (LCR) eran mucho más bajos que los del tejido cerebral31. Está bien establecido que el aumento de NAAG es neuroprotector contra la neurotoxicidad mediada por el receptor de N-metil-d-aspartato (NMDA), incluida la lesión cerebral isquémica30. Se informó por primera vez que la HI ejercía efectos neuroprotectores en el accidente cerebrovascular isquémico, y estudios posteriores también encontraron sus efectos protectores en otros deterioros neurológicos, incluida la lesión cerebral traumática, la hemorragia subaracnoidea y las enfermedades neurodegenerativas32. De acuerdo con nuestros resultados, el aumento de NAAG inducido por HI también se observó en tejidos de la corteza de ratones con accidente cerebrovascular isquémico33. Aunque la capacidad del hidrógeno molecular para eliminar los radicales hidroxilo puede explicar en parte sus efectos neuroprotectores, los efectos reguladores sobre los NAAG también pueden ser responsables de sus beneficios protectores. Además, en nuestro estudio también se observó un aumento significativo en los niveles plasmáticos de dos intermedios del ciclo del ácido cítrico, el ácido cis-aconítico y el ácido málico, lo que indica que el HI puede acelerar el metabolismo energético mitocondrial. El ácido N-carbamoil-l-aspártico y la inosina son intermediarios del metabolismo de las pirimidinas y las purinas, respectivamente. El aumento de los dos metabolitos sugiere que el HI puede tener efectos moduladores sobre el metabolismo de los nucleósidos. Los niveles plasmáticos de otros DM, incluidos l-leucina, sarcosina, ácido l-glutámico y ácido l-láctico, variaron ligeramente según el HI.

Estudios recientes han proporcionado evidencia de que la modulación de la microbiota intestinal del huésped puede ser uno de los mecanismos que contribuyen a los efectos biológicos del consumo de hidrógeno exógeno. Qiu et al. demostraron que el tratamiento con solución salina saturada de hidrógeno podría modular la abundancia de Bacteroides, Bifidobacterias y Lactobacillus en las heces, lo que puede ser responsable de la mejora de los trastornos del metabolismo de los lípidos en ratones con dietas altas en grasas34. Jin et al. informaron que la liberación sostenida de H2 en el intestino mediante nanocápsulas de hidrógeno podría aumentar la abundancia de Akkermansia muciniphila y atenuar la enfermedad del hígado graso asociada a la disfunción metabólica35. En este estudio, la ingesta de HRW indujo cambios significativos en la estructura de la microbiota intestinal, mientras que no se observaron diferencias marcadas en la comunidad bacteriana en el grupo HI. Un estudio anterior demostró que el pico de concentración de hidrógeno en el intestino delgado después de la ingesta oral de 5 ppm de HRW era aproximadamente 20 veces mayor que el de la inhalación de gas hidrógeno al 4%36. La diferencia significativa en la concentración de hidrógeno en el intestino entre la ingesta de HRW y la HI puede contribuir a los diferentes efectos sobre la composición de la microbiota.

En nuestro estudio, la ingesta de HRW indujo un aumento significativo en la proporción de Lactobacillus, Ruminococcus, Clostridium XI, Elusimicrobium, Barnesiella y Aquabacterium, y una disminución en Bacteroides, Anaerotruncus, Desulfovibrio, Mucispirillum y Bifidobacterium. Lactobacillus y Bifidobacterium son las bacterias probióticas más comunes con efectos beneficiosos informados que incluyen ayudar a la digestión, reducir el estreñimiento, resistir infecciones, prevenir la diarrea del viajero y mejorar la enfermedad intestinal (EII)37. En nuestro estudio, la ingesta de HRW indujo un aumento significativo en la abundancia de Lactobacillus. La mayor abundancia de Lactobacillus inducida por la ingesta de HRW puede contribuir a los efectos beneficiosos de HRW. Aunque HRW también indujo una marcada disminución de Bifidobacterium, la abundancia relativa de Bifidobacterium es muy baja. Un estudio clínico reciente demostró que beber agua electrolizada alcalina (AEW) disuelta en hidrógeno durante dos semanas inducía un aumento de Bifidobacterium en voluntarios sanos38. Los diferentes valores de pH (HRW 7,5 frente a AEW 9,5) o la duración del tratamiento con hidrógeno (HRW 6 meses frente a AEW 2 semanas) pueden contribuir a los diferentes efectos sobre los niveles de Bifidobacterium. Se ha demostrado que la suplementación con Ruminococcus flavefaciens podría atenuar los efectos antidepresivos de la duloxetina sobre el comportamiento depresivo39, aunque el aumento de Ruminococcus también ha demostrado ser beneficioso respecto del estreñimiento inducido por antidepresivos39. Un estudio anterior demostró que 4 semanas de ingesta de HRW podrían ejercer efectos beneficiosos sobre el comportamiento depresivo en ratones mediante la supresión de la activación del inflamasoma40; los efectos antidepresivos de HRW pueden verse disminuidos por el aumento de Ruminococcus inducido por la ingesta a largo plazo de HRW según nuestro estudio. Clostridium XI pertenece a la clase Clostridia, de la que se ha informado que atenúa la inflamación y las enfermedades alérgicas41. También se ha demostrado que las especies de Clostridium pueden utilizar polisacáridos no digeribles y producir muchos ácidos grasos de cadena corta (AGCC), que ahora se consideran actores clave en las interacciones con el huésped que impactan en la salud y la enfermedad, especialmente dada la evidencia reciente de su capacidad para modificar el epigenoma y sus efectos sobre tejidos y órganos más allá del intestino42. El aumento de SCFA derivados de Clostridium XI también puede contribuir a los efectos de HRW. En un estudio de 345 individuos chinos, se demostró que los miembros del género Bacteroides son más abundantes en sujetos con diabetes tipo II en comparación con controles con metabolismo normal de la glucosa43. La mejora de la tolerancia a la glucosa y el efecto reductor de la hiperglucemia de la ingesta de HRW se han informado previamente9,44, lo que puede atribuirse a la disminución inducida por HRW en los niveles de Bacteroides. Los resultados de los análisis de correlación de Spearman revelaron una gran cantidad de correlaciones significativas entre la abundancia de Bacteroides y DM, incluidos el ácido urocánico, el ácido l-láctico, la N-acetil-d-glucosamina y la N-acetil-l-tirosina; sin embargo, Es necesario investigar más a fondo las relaciones causales entre las alteraciones en la abundancia de Bacteroides y la DM plasmática. Aunque los niveles de otros géneros, incluidos Elusimicrobium, Barnesiella, Aquabacterium, Anaerotruncus, Desulfovibrio, Mucispirillum y Bifidobacterium cambiaron significativamente, su abundancia relativa fue muy baja.

En comparación con el grupo HRW, se encontró que los cambios en la microbiota fecal fueron mucho menores en el grupo HI. Entre estos géneros modificados, la abundancia de Blautia y Paraprevotella aumentó significativamente. Blautia se ha considerado una bacteria probiótica que se encuentra ampliamente en las heces y los intestinos de los mamíferos45. La mayor abundancia de Blautia puede contribuir a los efectos de HI. Se ha encontrado que el género Paraprevotella tiene una correlación negativa con el índice de IMC46. Consistentemente, también se observó una correlación negativa entre la abundancia del género Paraprevotella y el peso corporal de las ratas. Los análisis de correlación de Spearman revelaron una gran cantidad de correlaciones significativas entre la abundancia de Blautia y DM, los análisis de correlación revelaron correlaciones negativas significativas entre la abundancia de Blautia y DM, incluida la L-leucina y el ácido málico. La abundancia de Paraprevotella se correlacionó negativamente con los DM, incluidos la inosina, el ácido cis-aconítico y el ácido N-carbamoil-l-aspártico. Los otros géneros modificados, incluidos Elusimicrobium, Propionibacterium, Porphyrobacter, Methanosphaera y Bifidobacterium, tenían una abundancia relativamente baja.

Aunque tanto HRW como HI tienen efectos beneficiosos en diversas enfermedades, los mecanismos subyacentes pueden ser diferentes. Para la ingesta de HRW, se ha informado que muchos tipos de enfermedades, especialmente síntomas gastrointestinales, como estreñimiento y diarrea, podrían beneficiarse de HRW. Se sabe que la microbiota intestinal desempeña un papel importante en la salud y la enfermedad; el efecto modulador de HRW sobre la microbiota intestinal puede contribuir significativamente a la mejora de estas enfermedades. En nuestro estudio, los resultados de los experimentos en jaulas metabólicas mostraron que HI indujo cambios significativos en la ingesta de alimentos/agua de las ratas, lo que se correlaciona positivamente con cambios en la defecación/micción, mientras que no se observó ningún efecto obvio en el grupo HRW. Las razones de la disminución en la ingesta de alimentos son multifactoriales e involucran mecanismos tanto periféricos como centrales47. Hyspler y cols. utilizaron gas deuterio como trazador metabólico para cuantificar el metabolismo del hidrógeno en el cuerpo de los mamíferos y descubrieron que el deuterio se puede oxidar a agua48. En nuestro estudio, el gas hidrógeno inhalado probablemente puede oxidarse a agua, proporcionando un suministro endógeno de H2O, lo que podría explicar la disminución en la ingesta de agua de las ratas. Además, en nuestros estudios anteriores hemos proporcionado evidencia preliminar de que los eucariocitos tienen la capacidad de metabolizar el hidrógeno, lo que puede afectar sus actividades metabólicas49,50. Por lo tanto, es posible plantear la hipótesis de que la HI puede ejercer su función biológica mediante la modulación de la función metabólica de las mitocondrias, aunque esto debe investigarse más a fondo.

Una limitación del presente estudio es que la investigación sobre los efectos de la intervención con hidrógeno en los perfiles de la microbiota fecal se centró a nivel de género y no realizó estudios en profundidad a nivel de especie o incluso de cepa. Otra limitación es la falta de relaciones causales comprobadas entre las alteraciones en los perfiles de la microbiota y los metabolitos plasmáticos. Además, más estudios también deberían evaluar los efectos de la intervención con hidrógeno en la producción de SFCA, que desempeñan un papel clave en las interacciones entre la microbiota y el huésped.

En conjunto, los resultados de este estudio podrían proporcionar datos básicos para futuras investigaciones sobre la medicina del hidrógeno. Nuestros resultados también arrojan luz sobre los efectos de diferentes rutas de intervención del hidrógeno en los perfiles de la microbiota, lo que puede contribuir significativamente a los efectos terapéuticos del hidrógeno en diversas enfermedades.

Los métodos de experimentación con animales se informaron en nuestro estudio anterior de la siguiente manera: se compraron dieciocho ratas Sprague-Dawley macho de 3 semanas de edad que pesaban entre 40 y 50 g de Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (Beijing, China). Las ratas se alojaron a una temperatura constante de 22 a 25 °C con un ciclo de luz y oscuridad de 12 h y se mantuvieron con una dieta normal. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Experimentación con Animales del Hospital General Chino del EPL y se llevaron a cabo de conformidad con el Reglamento para la Administración de Asuntos Relativos a Animales de Experimentación (China) y las directrices ARRIVE. Antes del experimento, las ratas fueron adaptadas a las condiciones de laboratorio durante una semana. Luego, las ratas se dividieron aleatoriamente en tres grupos (6 en cada grupo): (1) Grupo de control: las ratas se mantuvieron en condiciones normales; (2) Grupo HRW: las ratas recibieron HRW por vía oral durante 1 h cada vez, dos veces al día; (3) Grupo HI: las ratas fueron tratadas con HI (4%) durante 1 h cada vez, dos veces al día. El experimento duró seis meses. Se recolectaron muestras de heces frescas mediante operación estéril antes del sacrificio y se almacenaron inmediatamente a -80 °C para el análisis de la microbiota. Después de la eutanasia, se tomaron inmediatamente muestras de sangre de la vena porta. Las muestras de plasma se obtuvieron centrifugando la sangre completa a 1500 g durante 10 minutos a 4 °C y se almacenaron a -80 °C para un análisis metabonómico pseudodirigido.

Shenzhen Kelieng Biomedical Co. Ltd. (Shenzhen, China) proporcionó amablemente HRW (concentración de H2> 800 µM) y lo almacenó a presión atmosférica a 23 ± 2 ° C en un balde de acero inoxidable (KLE-8). La concentración de hidrógeno se controló utilizando un electrodo de hidrógeno (Unisense A/S, Aarhus, Dinamarca), asegurando que la concentración de hidrógeno de HRW para ratas se mantuviera por encima de 800 µM.

Las ratas se colocaron en una caja cerrada transparente (72 × 53 × 45 cm, largo × ancho × alto) conectada al generador de gas hidrógeno que estaba compuesto por una máquina de oxihidrógeno (SG-3000; Gang'an Health Management [Beijing] Co. ., Ltd., Beijing, China) y un mezclador de gas, se les permitió la respiración espontánea (4% H2, 96% aire que contiene 21% O2) durante 1 h cada vez y dos veces al día. La concentración de hidrógeno y oxígeno en la caja cerrada se controló mediante cromatografía de ultragas GC de traza térmica (Thermo Fisher, MA, EE. UU.).

Se adquirieron ratas macho Sprague-Dawley (220 ± 20 g) de Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (Beijing, China) y se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 8 en cada grupo): CON, HRW y HI. grupo. Se monitorizó la función metabólica de las ratas durante 4 semanas. Las ratas se alojaron individualmente en jaulas metabólicas (Techniplast, Reino Unido) una vez por semana. La ingesta de alimentos se calculó mediante el peso restante de los alimentos a partir del peso de los alimentos suministrados el día anterior. La ingesta de agua se calculó restando la cantidad de agua restante de la cantidad medida de agua suministrada el día anterior. Se recogieron y midieron las heces y la orina durante las 24 h. El BW fue monitoreado durante las cuatro semanas. Los datos se analizaron mediante medidas repetidas ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de Tukey utilizando GraphPad Prism 8.0.2 y se presentaron como media ± DE. El análisis de correlación de Spearman se realizó con GraphPad Prism 8.0.2.

Para identificar los DM en plasma, se realizó el enfoque de metabolómica pseudodirigida, que permite identificar y cuantificar 200 metabolitos plasmáticos. Las muestras de plasma se descongelaron a 4 °C y se agitaron completamente. Para cada muestra, se tomaron 100 µL y se transfirieron a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Luego se añadieron 400 µl de metanol/acetonitrilo helado (1:1, v/v). Las muestras se mezclaron mediante agitación vigorosa, se sonicaron en un sonicador de baño de agua helada durante 20 minutos y se mantuvieron a -20 °C durante 1 h. A continuación, las muestras se centrifugaron a 14.000 g durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante se transfirió a un vial de vidrio para muestras y se secó al vacío a 4 °C. Luego se agregaron 100 µL de acetonitrilo/agua (1:1, v/v) antes de la centrifugación a 14.000 g durante 20 min a 4 °C. Los sobrenadantes resultantes se utilizaron para análisis metabolómicos. Las muestras de control de calidad (QC) se prepararon mezclando volúmenes iguales de todas las muestras de plasma con todos los demás pasos como se describe anteriormente.

La separación cromatográfica del plasma se llevó a cabo en un sistema de cromatografía líquida Waters I clase con columna ACQUITY UPLC BEH Amide (columna de 1,7 µm, 2,1 × 100 mm, Waters). El sistema de fase móvil consta de acetato de amonio 25 mM + amoníaco 25 mM (pH 9,75) (A) y acetonitrilo (B). La temperatura de la columna se mantuvo a 40 °C y el caudal fue de 0,3 ml/min. El volumen de inyección de muestra fue de 2 µl. El gradiente lineal para la fase móvil B fue el siguiente: 0–1 min 95% B; 1 a 14 min, 95 % a 65 %; 14 a 16 min, 65% a 40%; 16 a 18 min, 40% B; 18 a 18,1 min, 40% a 95%; 18,1–23 min, 95 % B. Las muestras de control de calidad se inyectaron a intervalos regulares (cada 6 muestras) durante todo el análisis.

La adquisición masiva de datos se realizó utilizando un 5500 QqQ MS (AB SCIEX). La detección se realizó mediante los modos positivo y negativo de ESI. Los parámetros de MS se establecieron de la siguiente manera: temperatura del gas de envoltura, 350 °C; temperatura del gas seco, 350 °C; flujo de gas envolvente, 11 l/min; flujo de gas seco, 10 L/min; voltaje capilar, 4000 V o − 3500 V en modo positivo o negativo, respectivamente; voltaje de la boquilla, 500 V; y presión del nebulizador, 30 psi. Para la detección se utilizó el modo de monitorización de reacciones múltiples (MRM). El tiempo de permanencia de cada par iónico fue de 3 ms y el tiempo total del ciclo fue de 1,263 s. Los datos metabolómicos originales basados en MRM se analizaron utilizando MRMAnalyzer (R) como se informó anteriormente34.

Primero se realizó un análisis PCA no supervisado para visualizar las tendencias generales de todas las muestras. Luego, se utilizó un modelo OPLS-DA supervisado para clasificar las muestras y encontrar las variables relevantes relacionadas con la agrupación de la muestra. Se utilizó el software SIMCA-p (versión 14.1, https://www.sartorius.com) para realizar análisis PCA y OPLS-DA. El modelo fue validado con 200 permutaciones aleatorias para evaluar la variación predictiva del modelo. Las puntuaciones de importancia de las variables en las proyecciones (VIP) obtenidas del modelo OPLS-DA se utilizaron para evaluar la contribución de cada variable al modelo establecido. Los metabolitos que tenían VIP > 1 y p < 0,05 se identifican como metabolitos significativamente modificados. Se utilizó MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/) para el análisis de enriquecimiento funcional de los metabolitos alterados. Todos los valores de p se corrigieron utilizando la corrección de prueba múltiple de Benjamini-Hochberg.

El ADN genómico total se aisló de las heces utilizando el mini kit QIAamp Fast DNA taburete (QIAGEN, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La calidad y cantidad del ADN extraído se midieron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). La región V3-V4 del gen 16S rRNA se amplificó con el cebador directo 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3' y el cebador inverso 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'. Los códigos de barras específicos de la muestra se agregaron a los extremos de los cebadores. El programa de PCR se configuró de la siguiente manera: 98 °C 10 min, 25 ciclos de 98 °C 15 s, 55 °C 30 s, 72 °C 30 s y 72 °C 5 min. Los productos de amplificación se purificaron y luego se secuenciaron en la plataforma Illumina MiSeq con el kit de reactivos MiSeq v3.

Los datos de secuenciación se analizaron utilizando el paquete QIME (versión 1.9.1). Las lecturas de alta calidad (puntuación de calidad ≥ 20) se ensamblaron en etiquetas mediante FLASH (versión 1.2.11). Las etiquetas con > 97% de identidad de secuencias se agruparon en OTU utilizando USEARCH (versión 10.0) y se utilizó UCHIME (versión 8.1) para identificar y eliminar secuencias quiméricas. Se seleccionó una secuencia representativa de cada OTU y se sometió a BLAST para asignar una clasificación taxonómica utilizando la base de datos SILVA (versión 132).

Los índices de diversidad alfa fueron calculados por QIIME (versión 1.9.1). Se realizó un análisis de similitud unidireccional (ANOSIM) para determinar las diferencias en las comunidades bacterianas entre los grupos. Las diferencias en los índices de diversidad alfa y las abundancias relativas de filos, familias y géneros entre grupos se calcularon mediante el uso de la prueba t de muestra independiente (para los datos distribuidos normalmente) o la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (para los datos no distribuidos normalmente). ). Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05. Se utilizó la investigación filogenética de comunidades mediante la reconstrucción de estados no observados (PICRUSt) para obtener información relativa sobre la abundancia de la vía de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG)51,52,53,54.

La correlación de Spearman entre la abundancia relativa de géneros y el nivel de metabolitos plasmáticos se calculó en el software R (versión 3.2.1, https://www.r-project.org/) y se visualizó utilizando el paquete ComplexHeatmap (versión 2.9.3, http ://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ComplexHeatmap.html) en el software R (versión 3.2.1).

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Este trabajo fue apoyado por Proyectos Abiertos de Investigación Clave de Logística Militar (BHJ17L018).

Estos autores contribuyeron por igual: Fei Xie, Xue Jiang y Yang Yi.

Facultad de Medio Ambiente y Vida, Universidad Tecnológica de Beijing, No. 100, Pingleyuan, Distrito Chaoyang, Beijing, 100124, China

Fei Xie, Xue Jiang, Yang Yi, Zi-Jia Liu, Chen Ma, Jin He, Zhi-ming Xun, Meng Wang, Meng-yu Liu, Yao Mawulikplimi Adzavon, Peng-xiang Zhao y Xue-mei Ma

Centro de Investigación del Hidrógeno Molecular de Beijing, Beijing, 100124, China

Fei Xie, Xue Jiang, Yang Yi, Zi-Jia Liu, Chen Ma, Jin He, Zhi-ming Xun, Meng Wang, Meng-yu Liu, Yao Mawulikplimi Adzavon, Peng-xiang Zhao y Xue-mei Ma

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X.-M. y FX diseñó el proyecto general. FX, XJ, YY, Z.-jL y CM realizaron los experimentos con animales. JH y Z.-X. realizó el análisis de metabolómica pseudodirigida basado en LC-MS, MW y M.-L. realizó la secuenciación del gen 16S rRNA, FX analizó los datos y escribió el manuscrito, Y.-A., P.-Z. y X.-M. revisó el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Xue-mei Ma.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Xie, F., Jiang, X., Yi, Y. et al. Diferentes efectos de la ingesta de agua rica en hidrógeno y la inhalación de gas hidrógeno sobre el microbioma intestinal y los metabolitos plasmáticos de ratas en estado de salud. Representante científico 12, 7231 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11091-1

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Recibido: 01 de agosto de 2021

Aceptado: 31 de marzo de 2022

Publicado: 04 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11091-1

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